La destacada colección de arte virreinal, que hoy custodia el Museo Nacional de Arte, se formó principalmente en dos etapas: la primera abarca de 1982, año de la fundación del MUNAL, hasta 1998, y la segunda surge a partir de 1999, momento en que la colección de la Pinacoteca Virreinal de San Diego se incorporó al acervo del Museo. Gracias a esta última adjudicación, el MUNAL se ha convertido en el poseedor de la colección de arte colonial más importante de todo el país.
Este conjunto de arte virreinal tiene una larga historia que inició en 1783 con la fundación de la Academia de San Carlos. En 1820, el acervo de las galerías de esta institución educativa, que conjuntaba obra de profesores y alumnos, se incrementó gracias a piezas procedentes de congregaciones hospitalarias y conventos, así como con las obras que se adquirieron hacia 1843, cuando la Academia se benefició de las rentas que recibía de la Lotería Nacional. Las pinturas provenientes de los conventos clausurados por las Leyes de Reforma, emitidas por Benito Juárez en 1859, también fueron agregadas a su acervo.
A principios del siglo XX, la institución se incorporó a la Universidad Nacional, con lo que dichas colecciones pasaron a su custodia. En 1934, una selección de pinturas pasó al Museo Nacional de Artes Plásticas, ubicado entonces en el Palacio de Bellas Artes. En 1964, un lote de pintura colonial se adjudicó a la Pinacoteca Virreinal de San Diego, mismas que se transfirieron en 1999 al MUNAL y se presentan al público a partir del año 2000.
A partir del Proyecto MUNAL 2000, el recorrido histórico-artístico patentizó los distintos proyectos de nación desde el siglo XVI hasta mediados del XX; fue un discurso fincado no tanto en las piezas sino en el proceso histórico que éstas entrañan.
El recorrido de esta sección ocupa 14 salas y lleva por nombre Asimilación de Occidente: la pintura en la Nueva España (1550-1821). Este mismo núcleo se divide en cuatro grandes ejes temáticos que van paralelos al proceso histórico y estilístico de tres siglos.
En el primer rubro, Transplante y asimilación, se representan los primeros artistas que llegaron de España y a su vez formaron a las primeras generaciones de artistas novohispanos; entre ellos se incluyen obras del maestro Baltasar de Echave Orio y su hijo Baltasar de Echave Ibía. En Contrastes lumínicos de color se encuentran aquellos artistas del siglo XVII que desarrollaron el trabajo del claroscuro encontrando en él una nueva forma expresiva que derivó en todo un lenguaje plástico. Le siguen las salas donde se exhibe el apartado Reelaboraciones y novedades pictóricas, que, como su nombre lo indica, manifiesta las novedades artísticas que se gestaron en el periodo y que encabezaron pintores como Miguel Cabrera o los hermanos Rodríguez Juárez. Por último, el Nacimiento de un proyecto Ilustrado denota los inicios y fundación de la Real Academia de las Tres Nobles Artes, en donde las figuras de Manuel Tolsá y Gerónimo Antonio Gil aparecen dignamente representadas.
Actualmente, la colección de arte novohispano custodia 411 obras, entre las que se conservan piezas de arte plumario, acuarelas sobre vitelas y una buena cantidad de tablas del siglo XVI y principios del XVII, con un elenco de los principales exponentes de este periodo. Asimismo, los mejores maestros de la pintura de los siglos XVII y XVIII conviven en este espacio y se hacen presentes en la colección.